蔡金艷 張錦文 唐菲 張小瓊 徐江濤 張勇慧
1. 廣東藥學(xué)院·藥科學(xué)院，廣東廣州510006;
2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北武漢430030;
3. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院·藥學(xué)院，湖北武漢430030;
4. 湖北省天然藥物化學(xué)與資源評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430030）
摘要： 目的對(duì)金線蓮Anoectochilus roxburghii （ Wall. ） Lindl. 中富含的主要成分kinsenoside 進(jìn)行抗癌活性研究。方法采
用磺酰羅單明Sulforhodamine B （ SRB） 法和MTT 分析法。結(jié)果對(duì)3 種敏感細(xì)胞株： 人白血病細(xì)胞株（ HL － 60 ） 、人肺癌
細(xì)胞株（ A － 549） 、人肝癌細(xì)胞株（ BEL － 7402） 篩選結(jié)果10 － 5mmol /L 的化合物kinsenoside 時(shí)抑制率均小于85%，評(píng)定
為無(wú)效。結(jié)論化合物kinsenoside 的抗癌活性不顯著。
關(guān)鍵詞： 金線蓮； kinsenoside; 抗癌
DOI 標(biāo)識(shí)： doi: 10. 3969 /j. issn. 1008-0805. 2010. 10. 011
中圖分類(lèi)號(hào)： R962 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1008-0805（ 2010） 10-2444-02
金線蓮（ Herba Anoectochili） 為蘭科開(kāi)唇蘭屬植物花葉開(kāi)唇蘭Anoectochilus roxburghii（ Wall. ）Lindl. 的干燥全草，是多年生珍稀中草藥，有清涼解毒、滋陰降火、消炎止痛之功效，可用于治療肺結(jié)核咯血、糖尿病、腎炎、膀胱炎、重癥肌無(wú)力、遺精、風(fēng)濕性及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小兒驚風(fēng)、婦女白帶以及毒蛇咬傷等癥； 生于山地林下陰濕地，在我國(guó)分布于浙江、福建、臺(tái)灣、江西、西藏等省區(qū)［1］，俗稱“金草”“神藥”“藥王”“烏人參”等?；瘜W(xué)成分方面除發(fā)現(xiàn)金線蓮中氨基酸，微量元素及糖類(lèi)的含量高外，還有黃酮類(lèi)、甾體、三萜類(lèi)等化合物分離鑒定的報(bào)道［2 ～ 4］。通過(guò)對(duì)野生金線蓮的化學(xué)成分研究，鑒定了兩個(gè)丁酸苷類(lèi)化合物β － D － glucopyranosyl－ （ 3R） – hydroxybutanolide （ Ⅰ，kinsenoside），methyl 4 － β － D － glucopyranosyl － butanoate（ Ⅱ） ［5］，并發(fā)現(xiàn)kinsenoside 含量很高。Kinsenoside 作為開(kāi)唇蘭屬多種植物含有的主要成分，其降血糖［6］、保肝護(hù)肝［7］、降血脂［8］等活性已多有研究。本實(shí)驗(yàn)選取3 種敏感的腫瘤細(xì)胞株，對(duì)該化合物進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)試。
1 材料與試劑
1. 1 腫瘤細(xì)胞株和培養(yǎng)基人白血病細(xì)胞株HL － 60、人肺癌細(xì)胞株A － 549、人肝癌細(xì)胞株BEL － 7402 （ 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)） 培養(yǎng)在含10%胎牛血清（ 杭州四季青生物工程材料有限公司） 的RPMI 1640 培養(yǎng)基（ Gibco 公司） 中，培養(yǎng)條件為： 37℃，飽和濕度，5% CO2的培養(yǎng)環(huán)境。
1. 2 試劑3 － （ 4，5 － dimethylthiazol － 2 － yl）－ 2，5－ diphenyl tetrazolium bromide（ MTT） （ Sigma公司） 溶解在過(guò)濾除菌的1 × PBS （ pH 值7. 4，NaCl 0. 8%，KCl 0. 02%，Na2HPO40. 144%，KH2 PO4 0. 024% ） ，終濃度0. 5 mg /ml; SRB （ 美國(guó)Sigma 公司） 溶解在1% 的乙酸，終濃度4 mg /ml; SDS（ 北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展有限公司） 溶解在10 mmol /L 的鹽酸中，終濃度為10%; 注射用鹽酸阿霉素（ Adriamycin，ADM） 購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。
受試藥kinsenoside 純度經(jīng)鑒定在98% 以上； 金線蓮藥材由福建省漳州市南靖縣和溪鎮(zhèn)供銷(xiāo)社提供，由中國(guó)科學(xué)院武漢植物研究所王映明教授鑒定。
2 方法
2. 1 MTT 比色法體外抗腫瘤藥物篩選取處于指數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞種在96 孔板里（ 細(xì)胞濃度為20 000 個(gè)/ml， 100 μl /孔） ，培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞貼壁，去除上清，加200 μl /孔帶藥新鮮培養(yǎng)基：化合物事先溶解在DMSO 或者生理鹽水里，當(dāng)測(cè)試時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，注意DMSO 終濃度不能超過(guò)0. 1%。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照孔（ 只加培養(yǎng)基） 和陰性對(duì)照，同樣設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)要求時(shí)間，去除上清，加100 μl /孔濃度0. 5 mg /ml 的MTT。培養(yǎng)4 h 后再補(bǔ)加100 μl /孔的10%的SDS。37℃下10 h 后取出，微震蕩5 min，放置室溫下30 min，在A570nm 波長(zhǎng)下測(cè)OD 值，并計(jì)算抑制率。
抑制率（ %） =對(duì)照組OD 值－ 測(cè)試組OD 值對(duì)照組OD 值× 100%
2. 2 SRB 法體外抗腫瘤藥物篩選取處于指數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞種在96 孔板里（ 細(xì)胞濃
度為20 000 個(gè)/ml， 100 μl /孔） ，培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞貼壁，去除上清，加200 μl /孔帶藥新鮮培養(yǎng)基： 化合物事先溶解在DMSO 或者生理鹽水里，當(dāng)測(cè)試時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，注意DMSO 終濃度不能超過(guò)0. 1%。每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照孔（ 只加培養(yǎng)基） 和陰性對(duì)照，同樣設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)至試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間，終止培養(yǎng)，去除上清，每孔加10% TCA 200 μl，4℃條件固定l h。用二次蒸餾水
沖洗5 遍，自然晾干后每孔加入4 mg /ml SRB 溶液，室溫下染色15 min，棄上清，用1%乙酸沖洗5 遍以去除非特異性結(jié)合的染料。每孔加入100 μl 10 mmol /L Tris溶液，在A515nm 波長(zhǎng)下測(cè)OD 值，并計(jì)算抑制率（ 計(jì)算方法同MTT 比色法） 。
3 結(jié)果
見(jiàn)表1 ～ 2。
4 討論
從上述的測(cè)試結(jié)果來(lái)看，化合物kinsenoside 對(duì)敏感細(xì)胞株初篩的細(xì)胞毒活性不明顯，不再進(jìn)行其他細(xì)胞株的復(fù)篩。本研究將化學(xué)與藥理方面有機(jī)結(jié)合起來(lái)，對(duì)金線蓮中富含［8］的主要成分kinsenoside在抗腫瘤方面的藥理活性進(jìn)行了測(cè)試，為全面評(píng)價(jià)活性化合物kinsenoside的藥理作用和藥用價(jià)值提供了科學(xué)依據(jù)。王常青等［9］初步研究表明，金線蓮多糖對(duì)癌細(xì)胞具有較好的殺傷作用。
參考文獻(xiàn)：
